维生素A、维生素E的测定－高效液相色谱法

                             中华人民共和国国家标准

                               GB T 5009.82 2003

                   果品制品－维生素A、维生素E的测定－高效液相色谱法

1 范围

本方法适用于各类果品制品中维生素A和维生素E的测定。

本方法的检出限分别为：VA：0.8ng；α-E：91.8ng；γ-E：36.6ng；δ-E：20.6ng。

2 原理

试样中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。

3 试剂

3.1 无水硫酸钠；

3.2 抗坏血酸溶液（100g/L）：临用前配制；

3.3 氢氧化钾溶液（1+1）；

3.4 氢氧化钠溶液（100g/L）；

3.5 硝酸银溶液（50g/L）；

3.6 无水乙醚：不含有过氧化物；

3.6.1 过氧化物检查方法：用5mL乙醚加1mL10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉溶液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用；

3.6.2 去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许。弃去10%初馏液和10%残馏液。

3.7 无水乙醇：不得含有醛类物质；

3.7.1 检查方法：取2mL银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛；

3.7.2 脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50mL。当乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适当增加。

3.8 甲醇：重蒸后使用；

3.9 重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏；

3.10 银氨溶液：加氨水至硝酸银溶液中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加氢氧化钠溶液数滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解；

3.11 维生素A标准液：视黄醇（纯度85%）或视黄醇乙酸酯（纯度90%）经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度；

3.12 维生素E标准液：α-生育酚（纯度95%），γ-生育酚（纯度95%），δ-生育酚（纯度95%）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg。临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确浓度；

3.13 内标溶液：称取苯并[e]芘（纯度98%），用脱醛乙醇配制成每1mL相当于10μg苯并[e]芘的内标溶液；

3.14 pH1～14试纸。

4 仪器与设备

4.1 实验室常用设备；

4.2 高压液相色谱仪带紫外分光检测器；

4.3 旋转蒸发器；

4.4 高速离心机，配有小离心管，具塑料盖1.5mL～3.0mL塑料离心管（与高速离心机配套）；

4.5 高纯氮气；

4.6 恒温水浴锅；

4.7 紫外分光光度计。

5 分析步骤

5.1 试样处理

5.1.1 皂化

　　称取1g～10g试样（含维生素A约3μg，维生素E各异构体约为40μg）于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加5mL10%抗坏血酸，苯并[e]芘标准液2.00mL，混匀。加10mL氢氧化钾（1＋1），混匀。于沸水浴上回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。

5.1.2 提取

将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分2次～3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。

5.1.3 洗涤

　　用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验直至水层不显碱性（最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加）。

5.1.4 浓缩

　　将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约5g）滤入与旋转蒸发器配套的250mL～300mL球形蒸发瓶内，用约100mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。立即加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。

5.1.5 将乙醇液移入一小塑料离心管中，离心5min（5000rpm）。上清液供色谱分析。如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容。并记下体积比。

    (下略)