维生素A和维生素E的测定－比色法

                           中华人民共和国国家标准

                             GB T 5009.82 2003

                    果品制品－维生素A和维生素E的测定－比色法

1 范围

本方法规定了果品制品中维生素A和维生素E的测定方法。

本标准适用于食品中维生素A和维生素E的测定。

本标准检出限分别为：VA：0.8ng；α－E：91.8ng；γ－E：36.6ng；δ－E：20.6ng。

2 原理

　　维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，产生蓝色物质，其深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。该蓝色物质虽不稳定，但在一定时间内可用分光光度计于620nm波长处测定其吸光度。

3 试剂

除非另有说明，在分析中仅使用确定为分析纯的试剂和蒸馏水或相当纯度的水。

3.1 无水硫酸钠； 

3.2 氢氧化钾溶液（1＋1）；

3.3 乙酸酐；

3.4 乙醚；

3.5 无水乙醇；

3.6 三氯甲烷：应不含分解物，否则会破坏维生素A：

3.6.1 检查方法：三氯甲烷不稳定，放置后易受空气中氧的作用生成氯化氢和光气。检查时可取少量三氯甲烷置试管中加水少许摇振，使氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸银液，如有白色沉淀即说明三氯甲烷中有分解产物；

3.6.2 处理方法：试剂应先测验是否含有分解产物，如有，则应于分液漏斗中加水洗数次，加无水硫酸钠或氯化钙使之脱水，然后蒸馏；

3.6　三氯化锑－三氯甲烷溶液（250g/L）：用三氯甲烷配制三氯化锑溶液，储于棕色瓶中(注意勿使吸收水分)；

3.7　维生素A或视黄醇乙酸酯标准液；

3.8　酚酞指示剂（10g/L）：用95%乙醇配制。

4 仪器

4.1 分光光度计；

4.2 回流冷凝装置。

5 分析步骤

维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。

5.1 试样处理

根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。

5.1.1 皂化法：适用于维生素A含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但全部试验过程费时，且易导致维生素A损失。

5.1.1.1 皂化：根据样品中维生素A含量的不同，称取0.5g～5g样品于三角瓶中，加入10mL氢氧化钾(1+1)及20mL～40mL乙醇，于电热板上回流30min至皂化完全为止。

5.1.1.2 提取：将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，以30mL水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。如有渣子，可用脱脂棉漏斗滤入分液漏斗内。用50mL乙醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分层后，水层放入第二个分液漏斗内。皂化瓶再用约30mL乙醚分二次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗中。振摇后，静置分层，水层放入三角瓶中，醚层与第一个分液漏斗合并。重复至水液中无维生素A为止。

5.1.1.3 洗涤：用约30mL水加入第一个分液漏斗中，轻轻振摇，静置片刻后，放去水层。加15mL～20mL0.5mol/L氢氧化钾液于分液漏斗中，轻轻振摇后，弃去下层碱液，除去醚溶性酸皂。继续用水洗涤，每次用水约30mL，直至洗涤液与酚酞指示剂呈无色为止(大约3次)。醚层液静置10 min～20min，小心放出析出的水。

5.1.1.4 浓缩：将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25mL乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内。置水浴上蒸馏，收回乙醚。待瓶中剩约5mL乙醚时取下，用减压抽气法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内。

5.1.2 研磨法：适用于每克样品维生素A含量大于5～10μg样品的测定。步骤简单，省时，结果准确。

5.1.2.1 研磨：精确称2g～5g样品，放入盛有3倍～5倍样品重量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。

5.1.2.2 提取：小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准确加入50mL～100mL乙醚。紧压盖子，用力振摇2min，使样品中维生素A溶于乙醚中。使其自行澄清(大约需1～2h)，或离心澄清(因乙醚易挥发，气温高时应在冷水浴中操作。装乙醚的试剂瓶也应事先放入冷水浴中)。

5.1.2.3 浓缩：取澄清提取乙醚液2mL～5mL，放入比色管中，在70℃～80℃水浴上抽气蒸干。立即加入1mL三氯甲烷溶解残渣。

6 测定

6.1 标准曲线的制备

准确取一定量的维生素A标准液于4～5个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。再取相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烷和标准系列使用液1mL，各管加入乙酸酐1滴，制成标准比色序列。于620nm波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将其标准比色列按顺序移入光路前，迅速加入9mL三氯化锑－三氯甲烷溶液。于6s内测定吸光度，将吸光度为纵坐标，以维生素A含量为横坐标绘制标准曲线图。

6.2 试样测定

　　于一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入1滴乙酸酐为空白液。另一比色管中加入1mL三氯甲烷，其余比色管中分别加入1mL样品溶液及1滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制备。

    (下略)