胡萝卜素的测定－高效液相色谱法

                         中华人民共和国国家标准

                            GB T 5009.83 2003

                  果品制品－胡萝卜素的测定－高效液相色谱法

1 范围

本方法适用于各类果品制品中胡萝卜素含量的测定。

本方法的检出限为5.0mg/kg（L）；线性范围为0mg/L～100 mg/L。

2 原理

试样中的β-胡萝卜素用石油醚+丙酮（80+20）混合液提取，经三氧化二铝柱纯化，然后以高效液相色谱法测定，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。

3 试剂

试剂除特别标明外，均为分析纯。

3.1 石油醚：沸程30℃～60℃；

3.2 甲醇：色谱纯；

3.3 丙醇；

3.4 己烷；

3.5 四氢呋喃；

3.6 三氯甲烷；

3.7 乙腈：色谱纯；

3.8 三氧化二铝：层析用，100目～200目，140℃活化2h，取出放入干燥器备用；

3.9 含碘异辛烷溶液：精确称取碘1mg，用异辛烷溶解并稀释至25mL，摇匀备用；

3.10 α-胡萝卜素标准溶液：精确称取1mgα-胡萝卜素，加入少量三氯甲烷溶解，然后用石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转入25mL容量瓶中，用石油醚定容，浓度为40μg/mL，于-18℃储存备用；

3.11 β-胡萝卜素标准溶液：精确称取β-胡萝卜素12.5mg于烧杯中，先用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转入50ml容量瓶中，用石油醚定容，浓度为250μg/mL， -18℃储存备用。两个月内稳定。根据所需浓度取一定量的β-胡萝卜素标准液用移动相稀释成100μg/mL；

3.12 β-胡萝卜素标准使用液：分别吸取β-胡萝卜素标准溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL于10mL容量瓶中，各加入移动相至刻度，摇匀后即得β-胡萝卜素标准系列，分别含β-胡萝卜素5，10，20，30，40，50μg/mL；

3.13 β-胡萝卜素异构体：精确称取1.5mgβ-胡萝卜素于10mL容量瓶中，冲入氮气，快速加入含碘异辛烷溶液10mL，盖上塞子，在距20W的荧光灯30cm处照射5min，然后在避光处用真空泵抽去溶剂，用少量三氯甲烷溶液结晶，再用石油醚溶解并定容至刻度，浓度为150μg/mL，-18℃保存。

4 仪器设备　

实验室常用仪器设备和下列仪器：

4.1 高效液相色谱仪；

4.2 离心机；

4.3 旋转蒸发仪。

5 操作步骤

5.1 检测样品的准备

5.1.1 吸取液态果品制品10.0mL试样于250mL分液漏斗中，加入石油醚+丙酮（80+20）20mL提取，然后静置分层，将下层水溶液放入另一分液漏斗中再提取，直至提取液无色为止。合并提取液，于旋转蒸发器上蒸发至干（水浴温度为40℃）。

5.1.3 称取固态果品制品10.0g试样于25mL带塞量筒中，加入石油醚+丙酮（80+20）提取。反复提取，直至上层提取液无色。合并提取液，于旋转蒸发器上蒸发至干（水浴温度为30℃）。

5.2 纯化

将试样提取液残渣用少量石油醚溶解，然后进行氧化铝层析。氧化铝柱为1.5cm（内径）×4cm（高）。先用洗脱液丙酮+石油醚（5+95）洗氧化铝柱，然后再加入溶解试样提取液的溶液，用丙酮+石油醚（5+95）洗脱β-胡萝卜素，控制流速为20滴/min，收集于10mL容量瓶中，用洗脱液定容至刻度。用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作HPLC分析。

5.3 测定

5.3.1 HPLC参考条件：

色谱柱：Spherisorb C18柱4.6mm×150mm；

流动相：甲醇+乙腈（90+10）；

流速：1.2mL/min；

波长：448nm。

5.3.2 标准曲线

分别进标准使用液20μL ，进行HPLC分析，以峰面积对β-胡萝卜素浓度作标准曲线。

5.3.3 试样测定

吸取已纯化的溶液20μL依法操作，从标准曲线查得或回归求得所含β-胡萝卜素的量。

    (下略)