硫胺素（维生素B1）的测定

                          中华人民共和国国家标准

                              GB T 5009.84 2003

                  果品制品－硫胺素（维生素B1）的测定－荧光分光光度法

1 范围

本方法适用于各类果品制品中硫胺素含量的测定。

本方法检出限为0.05μg；线性范围为0.2μg～10μg。

2 原理

硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线照射下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。如试样中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液作测定。

3 试剂

3.1 盐酸（0.1mol/L）：8.5mL浓盐酸（相对密度1.19或1.20）用水稀释至1000mL；

3.2 盐酸（0.3mol/L）：25.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL；

3.3 乙酸溶液：30mL冰乙酸用水稀释至1000mL；

3.4 氢氧化钠溶液（150g/L）：15g氢氧化钠溶于水中稀释至100mL；

3.5 无水硫酸钠；

3.6 乙酸钠溶液（2mol/L）：164g无水乙酸钠溶于水中稀释至1000mL；

3.7 氯化钾溶液（250g/L）：250g氯化钾溶于水中稀释至1000mL；

3.8 酸性氯化钾溶液（250g/L）：8.5mL浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000mL；

3.9 1%铁氰化钾溶液（10g/L）：1g铁氰化钾溶于水中稀释至100mL。放于棕色瓶内保存；

3.10 碱性铁氰化钾溶液：取4mL 10g/L铁氰化钾溶液，用150g/L氢氧化钠溶液稀释至60mL。用时现配，避光使用；

3.11 正丁醇：需经重蒸馏后使用；

3.12 淀粉酶和蛋白酶；

3.13 活性人造浮石：称取200g 40目～60目的人造浮石，以10倍于其容积的热乙酸溶液搅洗2次，每次10min；再用5倍于其容积的250g/L热氯化钾溶液搅洗15min；然后再用稀乙酸溶液搅洗10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子。于蒸馏水中保存；

3.14 硫胺素标准贮备液（0.1mg/mL）：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，溶于0.01mol/L盐酸中，并稀释至1000mL。于冰箱中避光保存；　　 

3.15 硫胺素标准中间液（10μg/mL）：将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释10倍。此溶液每毫升相当10μg硫胺素。于冰箱中避光可保存数月； 

3.16 硫胺素标准使用液（0.1mg/mL）：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍，用时现配； 

3.17 溴甲酚绿溶液（0.4g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4mL0.1mol/L氢氧化钠研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。

4 仪器

4.1 电热恒温培养箱；

4.2 荧光分光光度计；

4.3 Maizel-Gerson反应瓶；

4.4 盐基交换管。

5 分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 试样准备

　　样品采集后用匀浆机打成匀浆保存于低温冰箱中冷冻，用时将其解冻后使用。干燥试样要将其尽量粉碎后备用。

5.1.2 提取

5.1.2.1 准确称取适量试样（估计其硫胺素含量约为10μg～30μg,，一般称取2g～10g试样）置于100mL三角瓶中，加入50mL0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解，放入高压锅中加热水解，121℃30min，凉后取出。

5.1.2.2 用2mol/L乙酸钠调pH值为4.5（以0.4g/L溴甲酚绿为外指示剂）。

5.1.2.3 按每克试样加入20mg淀粉酶和40mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶。于45℃～50℃温箱过夜保温（约16h）。

5.1.2.4 凉至室温，定容至100mL，然后混匀过滤，即为提取液。

5.1.3 净化

5.1.3.1 用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的1/3高度。保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。

5.1.3.2 用移液管加入提取液20mL～60mL（使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为2μg～5μg）。

5.1.3.3 加入约10mL热蒸馏水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复三次。

5.1.3.4 加入20mL250g/L酸性氯化钾（温度为90℃左右），收集此液于25mL刻度试管内。冷至室温，用250g/L酸性氯化钾定容至25mL，即为试样净化液。

5.1.3.5 重复上述操作，将20mL硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替样品提取液，即得到标准净化液。

5.1.4 氧化

5.1.4.1 将5mL试样净化液分别加入A、B两个反应瓶。

5.1.4.2 在避光条件下将3mL150g/L氢氧化钠加入反应瓶A，将3mL碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将A、B两个反应瓶同时用力振摇1.5min。

5.1.4.3 重复上述操作，用标准净化液将代替试样净化液。

5.1.4.4 静置分层后吸去下层碱性溶液，加入2g～3g无水硫酸钠使溶液脱水。

5.2 测定

5.2.1 荧光测定条件：

　　激发波长365nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。

5.2.2 依次测定下列荧光强度：

a.　试样空白荧光强度（试样反应瓶A）；

b.　标准空白荧光强度（标准反应瓶A）；

c.　试样荧光强度（试样反应瓶B）；

d.　标准荧光强度（标准反应瓶B）。

    (下略)