核黄素的测定－微生物法

                            中华人民共和国国家标准

                              GB T 5009.85 2003

                         果品制品－核黄素的测定－微生物法

1 范围

本方法适用于各类果品制品中核黄素含量的测定。

2 原理

某一种微生物的生长（繁殖）必需某些维生素。例如干酪乳杆菌（Lactobacillus casei，简称L.C.）生长需要核黄素，培养基中若缺乏这种维生素该细菌就不能生长。在一定条件下，该细菌生长情况，以及它的代谢物乳酸的浓度和培养基中该维生素含量成正比，因此可以用酸度及混浊度的测定方法来测定试样中核黄素的含量。

3 试剂

3.1 盐酸（0.1mol/L）；

3.2 冰乙酸；

3.3 氢氧化钠溶液（1 mol/L和0.1 mol/L）；

3.4 氯化钠溶液（生理盐水，0.9g/L）：使用前应进行灭菌处理；

3.5 无水乙酸钠；

3.6 氢氧化铵；

3.7 乙酸铅；

3.8 干酪乳杆菌（Lactobacillus casei ATCC 7469）；

3.9 甲苯；

3.10 核黄素标准储备液（25µg/mL）：将标准品核黄素粉末结晶置于真空干燥器或盛有硫酸的干燥器中。经过24小时后，准确称取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4mL冰乙酸和1.5L水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室温，稀释至2L，移至棕色瓶内，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存；

3.11 核黄素标准中间液（10µg/mL）：准确吸取20mL标准储备液，加水稀释至50mL；

3.12 核黄素标准使用液（0.1µg/mL）：准确吸取1.0mL中间液于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。每次分析要配制新标准使用液；

3.13 碱处理蛋白胨：分别称取40g蛋白陈和20g氢氧化钠于250mL水中。混合后，放于37℃±0.5℃恒温箱内，24h～48h后取出，用冰乙酸调节pH至6.8，加14g无水乙酸钠（或23.2g含有3分子结晶水的乙酸钠），稀释至800mL，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存；

3.14 胱氨酸溶液（1g/L）：称取1g L-胱氨酸于小烧杯中。加20mL水，缓慢加入约5mL～10mL盐酸，直至其完全溶解，加水稀释至1L，加少许甲苯盖于溶液表面；

3.15 酵母补充液：称取100g酵母提取物干粉于500mL水中，称取150g乙酸铅于500mL水中，将两溶液混合，以氢氧化铵调节pH至酚酞呈红色（取少许溶液检验）。离心或用布氏漏斗过滤，滤液用冰乙酸调节pH至6.5。通入硫化氢直至不生沉淀，过滤，通空气于滤液中，以排除多余的硫化氢。加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存；

3.16 甲盐溶液：称取25g磷酸氢二钾和25g磷酸二氢钾，加水溶解，并稀释至500mL。加入少许甲苯以保存之；

3.17 乙盐溶液：称取10g硫酸镁（MgSO4•7H2O），0.5g硫酸亚铁（FeSO4•7H2O）和0.5g硫酸锰（MnSO4•4H2O），加水溶解，并稀释至500mL，加少许甲苯以保存之；

3.18 基本培养储备液：将下列试剂混合于500mL烧杯中，加水至450mL，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8，用水稀释至500mL

    碱处理蛋白胨    　　         100mL

    0.1%胱氨酸溶液　  　         100mL

    酵母补充液　　　  　         20mL

    甲盐溶液　　　　　           10mL

    乙盐溶液　　　　  　         10mL

    无水葡萄糖　　  　　         10g

3.19 琼脂培养基：将下列试剂混合于250mL三角瓶中，加水至100mL，于水浴上煮至琼脂完全溶化，用1mol/L盐酸趁热调节pH至6.8。尽快倒入试管中，每管3mL～5mL，塞上棉塞，于高压锅内在6.9×104Pa压力下灭菌15min，取出后直立试管，冷至室温，于冰箱中保存；

    无水葡萄糖　　　　　　　　　　 1g

　　乙酸钠(NaAc•3H2O)　　　　　　  1.7g

　　蛋白胨　　　　　　　　　　　   0.8g

　　酵母提取物干粉　　　　　　　　 0.2g

    甲盐溶液　　　　　　　　　　　 0.2mL

　　乙盐溶液　　　　　　　　　　　 0.2mL

　　琼脂　　　　　　　　　　　　　　1.2g

3.20 溴甲酚绿指示剂（0.4g/L）：称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4mL0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨，加少许水，继续研磨，直至完全溶解。用水稀释至250mL；

3.21 溴麝香草酚蓝指示剂（0.04%）：称取0.1g溴麝香草酚蓝于小研钵中，加1.6mL0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨。加少许水，继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。

4 仪器与设备

4.1 实验室常用设备；

4.2 电热恒温培养箱；

4.3 离心沉淀机；

4.4 液体快速混合器；

4.5 高压消毒锅。

5 菌种的制备与保存

5.1 储备菌种的制备：以L.C.纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中。在37℃±0.5℃恒温培养箱中保温16h～24h。贮于冰箱内，至多不超过2周，最好每周移种一次。保存数周以上的储备菌种，不能立即用于制备接种液，一定要在使用前每天移种一次，连续2d～3d方可使用，否则生长不好。

5.2 种子培养液的制备：取5mL核黄素标准使用液和5mL基本培养储备液于15mL离心管混匀，塞上棉塞，于高压锅内在6.9×104Pa压力下灭菌15min。每次可制备2管～4管。

6 分析步骤

因核黄素易被日光和紫外线破坏，故一切操作要在暗室内进行。

6.1 接种液的制备：使用前一天，将菌种由储备菌种管中移入已消毒的种子培养液中，同时制做两管。在37℃±0.5℃保温16h～24h。取出后离心10min（3000rpm），以无菌操作方法倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗二次，再加10mL消毒生理盐水，在液体快速混合器上振摇试管，使菌种成混悬体。将此液倾入已消毒的注射器内，立即使用。

6.2 试样的制备

6.2.1 将样品用磨粉机、研钵磨成粉末或用打碎机打成匀浆。

6.2.2 称取约含5μg～10μg的核黄素样品，加入50mL 0.1mol/L盐酸溶液，混匀。置于高压锅内，在10.3×104Pa压力下水解30min。

6.2.3 冷至室温，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至4.6（取少许水解液，用溴甲酚绿检验，溶液呈草绿色即可）。

6.2.4 加入淀粉酶或木瓜蛋白酶，每克样品加入20mg酶。在40℃恒温箱中过夜，大约16h。

6.2.5 冷至室温，加水稀释到100mL，过滤。对于脂肪量高的食物，可用乙醚提取，以除去脂肪。

6.3 标准管的制备

三组试管中每管各加核黄素标准使用液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL，每管加水至5mL，再每管加5mL基本培养储备液混匀。

6.4 试样管的制备

6.4.1 吸取试样溶液5mL～10mL，置于25mL具塞试管中，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH至6.8（取少许溶液，用溴麝香草酚蓝检验），加水稀释至刻度。

6.4.2 取两组试管，各加试样稀释液1，2，3，4mL，每管加水至5mL，每管再加5mL基本培养储备液混匀。

6.5 灭菌：将以上样品管和标准管全部塞上棉塞，置于高压锅内，在6.9×104Pa压力下灭菌15min。

6.6 接种和培养

6.6.1 待试管冷至室温，在无菌操作条件下接种，每管加一滴接种液，接种时注射器针头不要碰试管壁，要使接种液直接滴在培养液内。

6.6.2 置于37℃±0.5℃恒温箱中培养约72h，培养时每管必须在同一温度。培养时间可延长18h或减少12h。必要时可在冰箱内保存一夜再滴定。若用混浊度测定法，以培养18h～24h为宜。

6.7 滴定

将试管中培养液倒入50mL三角瓶中，加0.001%溴麝香草酚蓝溶液5mL，分二次淋洗试管，洗液倒至该三角瓶中，以0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定，终点呈绿色。以第一瓶的滴定终点作为变色参照瓶。约30min后再换一参照瓶，因溶液放置过久颜色变浅。

6.8 用标准核黄素溶液的不同浓度为横坐标及在滴定时所需0.1mol/L氢氧化钠的毫升数为纵坐标，绘制标准曲线。

    (下略)