中华人民共和国国家标准
GB T 5009.85 2003
果品制品－核黄素的测定－荧光法
1 范围
本方法适用于各类果品制品中核黄素含量的测定。
本方法检出限为0.006μg；线性范围为0.1μg～20μg。
2 原理
核黄素在440nm～500nm波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。在波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠（Na2S2O4），将核黄素还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为样品中核黄素所产生的荧光强度。
3 试剂
试验用水为蒸馏水。试剂不加说明为分析纯。
3.1 盐酸（0.1mol/L）；
3.2 氢氧化钠（1mol/L）；
3.3 氢氧化钠（0.1mol/L）；
3.4 硅镁吸附剂：60目～100目；
3.5 无水乙酸钠溶液（2.5mol/L）；
3.6 低亚硫酸钠溶液（200g/L）：此液用时现配。保存在冰水浴中，4h内有效；
3.7 洗脱液：丙酮＋冰乙酸＋水（5＋2＋9）；
3.8 溴甲酚绿指示剂：（0.4g/L）；
3.9 高锰酸钾溶液（30g/L）；
3.10 过氧化氢溶液（3%）；
3.11 木瓜蛋白酶（10%）：用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制；
3.12 淀粉酶（10%）：用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制；
3.13 核黄素标准溶液的配制（纯度98％）；
3.13.1 核黄素标准储备液（25μg/L）：将标准品核黄素粉状结晶置于真空干燥器中。经过24h后，准确称取50mg，置于2L容量瓶，加入2.4mL冰醋酸和1.5L水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室温，稀释至2L，移至棕色瓶内，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。
3.13.2 核黄素标准使用液：吸取2.00mL核黄素标准储备液，置于50mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度。避光，贮于4℃冰箱，可保存一周。此溶液每毫升相当于1.00μg核黄素。
4 仪器
4.1 实验室常用设备；
4.2 高压消毒锅；
4.3 电热恒温培养箱；
4.4 核黄素吸附柱；
4.5 荧光分光光度计。
5 分析步骤
整个操作过程需避光进行。
5.1 试样提取
5.1.1试样的水解
准确称取2g～10g样品（约含10μg～200μg核黄素）于100mL三角瓶中，加50mL0.1mol/L盐酸，搅拌直到颗粒物分散均匀。用40mL瓷坩埚为盖扣住瓶口，置于高压锅内高压水解，10.3×104Pa30min。水解液冷却后，滴加1mol/L氢氧化钠，取少许水解液，用0.4g/L溴甲酚绿检验呈草绿色，pH为4.5。
5.1.2 试样的酶解
5.1.2.1 含有淀粉的水解液：加入3mL10g/L淀粉酶溶液，于37℃～40℃保温约16h。
5.1.2.2 含高蛋白的水解液：加3mL10g/L木瓜蛋白酶溶液，于37℃～40℃保温约16h。
5.1.3 过滤
上述酶解液定容至100.0mL，用干滤纸过滤。此提取液在4℃冰箱中可保存一周。
5.2 氧化去杂质
视试样中核黄素的含量取一定体积的试样提取液及核黄素标准使用液（约含1μg～10μg核黄素）分别于20mL的带盖刻度试管中，加水至15mL。各管加0.5mL冰醋酸，混匀。加30g/L高锰酸钾溶液0.5mL，混匀，放置2min，使氧化去杂质。滴加3％双氧水溶液数滴，直至高锰酸钾的颜色退掉，剧烈震摇此管，使多余的氧气逸出。
5.3 核黄素的吸附和洗脱
5.3.1 核黄素吸附柱：硅镁吸附柱约1g用湿法装入柱，占柱长1/2～2/3（约5cm）为宜（吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上），勿使柱内产生气泡，调节流速约为60滴/min。
5.3.2 过柱与洗脱：将全部氧化后的样液及标准液通过吸附柱后，用约20mL热水洗去样液中的杂质。然后用5.00mL洗脱液将试样中核黄素洗脱并收集于一带盖10mL刻度试管中，再用水洗吸附柱，收集洗出之液并定容至10mL，混匀后待测荧光。
5.4 标准曲线的制备
分别精确吸取核黄素标准使用液0.3，0.6，0.9，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0mL（相当于0.3，0.6，0.9，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0μg核黄素）或取与试样含量相近的单点标准按核黄素的吸附和洗脱（5.3）步骤作。
5.5 测定
5.5.1 于激发光波长440nm，发射光波长525nm，测量试样管及标准管的荧光值。
5.5.2 待试样及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液（约5mL～7mL）中加0.1mL20％低亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20s内测定各管的荧光值，作各自的空白值。
(下略)
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