柚皮苷和新橙皮苷的测定－高效液相色谱法

                        国际公职分析化学家联合会

                               AOAC 999.05 

                  柑桔汁－柚皮苷和新橙皮苷的测定－高效液相色谱法

1 范围

本方法适用于柑桔汁及其相关产品中柚皮苷和新橙皮苷含量的检测。

样品中新橙皮苷和柚皮苷的含量范围：5μg/g橙汁～50μg/g橙汁。

2 原理

　　柑桔汁经过滤除去颗粒后，注入C18柱，柚皮苷和新橙皮苷与其他成分发生分离。用紫外分光光度计，在280nm处检测。

3 试剂

3.1 醋酸：色谱纯； 

3.2 乙腈：色谱纯；

3.3 二甲基甲酰胺：色谱纯；

3.4 二甲亚砜：色谱纯；

3.5 去离子水；

3.6 移动相（醋酸溶液＋乙腈：81＋19。）1～10mL色谱纯冰醋酸加到去离子水中，醋酸可以减少谱峰拖尾，并提高柱效。醋酸用量依柱而定，移动相中加入醋酸，增加了来自苯甲酸钠和山梨酸钾的峰干扰的可能性。移动相总体积为2L时，由1620mL水或醋酸溶液与380mL色谱纯级的乙腈构成；

3.7 标准物质柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷母液A：500μg/g，精确称取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷0.05g，置于100mL容量瓶。加10mL二甲基甲酰胺或二甲亚砜，混合直至溶解，再用移动相溶液稀释到刻度；

3.8 苯甲酸钠和山梨酸钾母液B：500μg/g，精确称取山梨酸钾和苯甲酸钠各0.05g，转入100mL容量瓶，用移动相溶液稀释到刻度；

3.9 工作标样：用移动相溶液稀释母液A，配制5个稀释度（1:5、1:10、1:20、1:50和1:100），得到工作标样浓度分别为100μg/g、50μg/g、25μg/g、10μg/g和5μg/g。取母液A和B各10mL到100mL容量瓶，用移动相稀释到刻度得到检测标样，用于检测移动相和柱的适用性，。

4 仪器

4.1 液相色谱仪：配置有泵、手动或自动进样装置、紫外检测装置、积分仪或数据收集装置以及柱温箱； 

4.2 色谱柱：填充剂是金属杂质含量低的高纯度硅；

4.3 预置柱　填充物为杂质含量少的高质量的C18柱；

4.4 过滤装置　如果试样用1:1的乙腈水溶液稀释，则采用带有玻璃纤维预滤器的，规格为25mm×0.45μm的尼龙制过滤器。如果试样未经稀释而过滤，则采用25mm×0.2μm Anotop Plus装置（Whatman No.6809-4022或6809-4025）或醋酸纤维素膜过滤装置。可以除去试样中的微粒。

5 试样准备

取试样10～20mL，25℃下，转速为10000g，离心10min。用25mm×0.2μm膜过滤。

如果不经离心，处理方式为：混匀试样，用（40＋60）乙腈溶液，按1＋1稀释。试样用带有25mm×0.45μm玻璃纤维膜的过滤装置过滤。

注：不可用醋酸纤维素、versapore或聚砜膜，因为它们不耐乙腈。也不可用聚偏氟乙烯或聚四氟乙烯膜，因为它们会吸收黄酮类物质。

6 色谱条件

操作条件：流速1.0mL/min；进样量20μL（如果试样经稀释，则取40μL）；紫外光检测波长280nm，满刻度吸光度单位（AUFS）为0.05，柱温保持在25℃～30℃。

7 检测

按检测条件检测样品中柚皮苷和新橙皮苷的峰面积或者峰高，与标准样品中柚皮苷和新橙皮苷的峰面积或得峰高进行比较后，确定样品中柚皮苷和橙皮苷的含量。

8 参考文献

官方农业化学家协会[美] （AOAC）官方分析方法《高效液相色谱法检测柑桔汁中的柚皮苷和新橙皮苷》（999.05）