总黄酮的测定

                       中国人民共和国国家标准

                           GB/T 16771-1997

              橙、柑、桔汁及其饮料－总黄酮的测定－分光光度法

1 范围

本方法规定了橙、柑、桔汁及其饮料中总黄酮的测定方法。

本方法适用于判定橙、柑、桔浓缩汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5%的橙、柑、桔汁饮料中总黄酮的测定。

2 原理

橙、柑、桔中的黄烷酮类（橙皮甙、新橙皮甙等）与碱作用，开环生成2、6-二羟基-4-环氧基苯丙酮和对甲氧基苯甲醛；在二甘醇环境中遇碱缩合生成黄色橙皮素查耳酮，其生成量相当于橙皮甙的量。在波长420nm处比色测定吸光度，扣除本底后，与标准系列比较定量。

3 试剂

本试验方法中，所用试剂均为分析纯；实验用水应符合GB 6682 中三级水规格。

3.1 氢氧化钠溶液（0.1mol/L）：称取4g氢氧化钠，加水溶解，定容至1000mL；

3.2 氢氧化钠溶液（4mol/L）：称取16g氢氧化钠，加水溶解，定容至100mL；

3.3 柠檬酸溶液（200g/L）：称取20g柠檬酸，加水溶解，定容至100mL；

3.4 二甘醇溶液［90%（V/V）］：量取90mL一缩二乙二醇（又名二甘醇），加10mL水，混匀，备用。pH=6，转移到100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀；

3.5 试剂空白溶液：量取20mL氢氧化钠溶液于50mL烧杯中，用柠檬酸溶液（200g/L）调至pH＝6，转移到100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。

3.6 橙皮甙标准溶液：称取0.0250g橙皮甙[Hisperidin(由Hesperetin及7-rhamnoglucoside组成)，分子式：C28H34O15，分子量：610.6，橙皮甙含量约为80%，（本法以80%计），精确至0.0001g，置50mL烧杯中，加20mL氢氧化钠溶液（0.1mol/L）溶解，用柠檬酸溶液（200g/L）调至pH=6，转移到100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。溶液中橙皮甙的含量为200mg/L。此标准溶液需当日配制。

4 仪器与设备

实验室常规仪器、设备及下列各项：

4.1 紫外分光光度计；

4.2 酸度计：精度0.1pH 单位；

4.3 恒温水浴：温控±1℃；

4.4 具塞试管与试管架；

4.5 分析天平：感量0.1mg；

4.6 天平：感量10mg。

5 试液的制备

称取一定量混合均匀的样品（浓缩汁2.00～5.00g；果汁10.0g；果汁饮料、水果饮料和果汁型碳酸饮料50.0g）于100mL烧杯中，加入10mL氢氧化钠溶液（0.1mol/L），用氢氧化钠溶液（4mol/L）调至pH=12。静置30min后，再用柠檬酸溶液（200g/L）调至pH=6，转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，用滤纸过滤，收集澄清滤液，备用。

6 试液的制备

6.1 工作曲线的绘制

分别吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00mL橙皮甙标准溶液（200mg/L）于六支具塞试管中，分别依次加入5.00，4.00，3.00，2.00，1.00，0.00mL试剂空白溶液，摇匀。再各加5.0mL二甘醇溶液、0.1mL氢氧化钠溶液（4mol/L），摇匀，配制成0.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0mg/L总黄酮标准系列溶液。将上述试管置于40℃水浴中保温10min。取出，在冷水浴中冷却5min。用1cm比色皿，以0.0mg/L标准溶液调整零点，在波长420nm处测定各溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标，相应的总黄酮浓度为横坐标，绘制工作曲线或计算回归方程。

6.2  测定

吸取1～5mL试液于具塞试管中，用试剂空白溶液，补加至5mL，加5.0mL二甘醇溶液，摇匀后加0.1mL氢氧化钠溶液（4mol/L），摇匀。同时吸取一份等量的试液按上述步骤不加氢氧化钠溶液（4mol/L），作为空白调零。以下步骤按6.1 操作，测定试液吸光度，从工作曲线上查出（或用回归方程计算出）试液中总黄酮的含量（C）。

    （下略）