酒石酸、苹果酸、柠檬酸、丁二酸的测定

                        中国人民共和国国家标准

                          GB/T 5009.187-2003

       果品制品－酒石酸、苹果酸、柠檬酸、丁二酸的测定－高效液相色谱法

1 范围

本标准规定了测定食品中有机酸（酒石酸、苹果酸、柠檬酸、丁二酸）的高效液相色谱法。

本标准适用于果蔬及其制品、饮料等食品中有机酸含量的测定。

本方法的检出限为：酒石酸0.1μg/mL、苹果酸0.3μg/mL、柠檬酸0.5μg/mL、丁二酸2.0μg/mL。

2 原理

食品试样经匀浆提取、离心后，样液经0.3μm滤膜抽滤，以（NH4）2HPO4-H3PO4缓冲溶液（pH＝2.7）为流动相，用高效液相色谱法在C18色谱柱上分离，于210nm处经紫外检测器检测，用峰高或峰面积标准曲线测定有机酸的含量。

3 试剂

本方法中所用试剂为分析纯，试验用水为重蒸水或同等纯度的水，经0.45μm滤膜真空抽滤。

3.1 磷酸（1mol/L）；

3.2 磷酸氢二铵溶液（1mol/L）；

3.3 乙醇（80%）；

3.4 有机酸标准溶液：称取酒石酸、苹果酸、柠檬酸各0.5000g；丁二酸0.1000g；用超滤水溶解后，定容至50mL。酒石酸、苹果酸、柠檬酸的浓度分别为10.0mg/mL，丁二酸为2.0mg/mL，此液为标准储备液。标准使用液：取5.00mL标准储备液于50mL容量瓶中用超滤水稀释到刻度。酒石酸、苹果酸、柠檬酸的浓度分别为1.0mg/mL，丁二酸为0.2mg/mL。

4 仪器

4.1 组织捣碎机；

4.2 恒温水浴箱；

4.3 高效液相色谱仪，配紫外可见光检测器；

4.4 酸度计；

4.5 针头过滤器，0.3μm合成纤维树脂滤膜。

5 分析步骤

5.1 试样处理

5.1.1 固体试样：称取50g试样于组织捣碎机中，加入100ml80%乙醇，匀浆1min。取一定量匀浆（相当于5g试样）以3000r/min离心10min分出上清液，转入50mL容量瓶中，残渣再用80%乙醇洗涤两次，每次15mL，离心10min，合并上清液，加80%乙醇至刻度，混匀，此液为提取液。取5.00mL提取液于蒸发皿中，在70℃恒温水浴上蒸去乙醇，残留物用重蒸水定量转入10mL具塞比色管内，加入1mol/L磷酸（H3PO4）0.2mL，用重蒸水定容到10mL，混匀。取部分样液经内装0.3μm滤膜的针头过滤器过滤，滤液供高效液相色谱分析用。

5.1.2 液体试样：准确吸取5.00mL试样（若试样中含二氧化碳应先加热除去；若试样中含有人工合成色素应先加入聚酰胺粉于70℃水浴中加热脱色，样液在3000r/min下离心10min，再取上清液），加入0.2mL1mol/L磷酸，用重蒸水稀释至10mL，经0.3μm滤膜过滤，滤液供分析用。

6 测定

6.1 色谱条件

预柱：C18柱，10μm，4.6mm×30mm。

分析柱：C18柱，5μm，4.6mm×250mm。

流动相：0.01mol/L磷酸氢二铵，用1mol/L磷酸调至pH＝2.70，临用前用超声波脱气。

流速：1mL/min。

进样量：20μL。

紫外检测器波长：210nm。

6.2 标准曲线的绘制

取标准使用液0.50、1.00、2.00、5.00、10.00mL，加入0.2mL1mol/L磷酸，用超滤水稀释至10mL，混匀。进样20μL，于210nm处测量峰高或峰面积，每个浓度重复进样2次~3次，取平均值。以有机酸的浓度为横坐标，色谱峰高或峰面积的均值为纵坐标，绘制标准曲线或经过线性回归得出回归方程。

6.3 试样测定

在与绘制标准曲线相同的色谱条件下，取20μL试样液注入色谱仪，根据标准曲线或线性回归方程，求出样液中有机酸的浓度。

    （下略）