维生素B6的测定－比浊法

                       中国人民共和国国家标准

                            GB/T 5009.154

                   果品制品－维生素B6的测定－比浊法

1 范围 

本标准规定了用微生物法测定食品中维生素B6的含量。

本标准适用于果品制品中的维生素B6的测定。

本方法检出限为0.1ng，线性范围为0.1ng~6ng。 

2 原理 

食品中某一种细菌的生长必须有某一种维生素的存在，卡尔斯伯（Sacharomyces Xarlsbrgensis）酵母菌需在有维生素B6存在的条件下才能生长，在一定条件下维生素B6的量与其生长呈正比关系。用比浊法测定该菌在样品液中生长的混浊度，与标准曲线相比较得出样品中维生素B6的含量。

3 试剂 

3.1 硫酸溶液（0.5 mol/L）：于2000mL烧杯中加入700mL水，28mL硫酸（H2SO4），用水稀释至1000mL；　 

3.2硫酸溶液（0.22 mol/L）：于2000mL烧杯中加入700mL水，12.32mL硫酸（H2SO4），用水稀释至1000mL；

3.3 氢氧化钠溶液（10 mol/L）：溶200g氢氧化钠于水中，稀释至500mL；　 

3.4 氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）：取10mL10 mol/L氢氧化钠溶液，用水稀释至1000mL；

3.5 琼脂；

3.6 吡哆醇Y培养基；　

3.7　培养基：称取吡哆醇Y培养基5.3g，溶解于100 mL蒸馏水中；

　　警告：本方法中所用吡哆醇Y培养基不得含维生素B6生长因子。

3.8 吡哆醇标准储备液（100μg/mL）：精确称取122mg盐酸吡哆醇标准品溶于1L25%乙醇中，保于4℃冰箱中，稳定1个月；

3.9 吡哆醇标准中间液（1μg/mL）：吸取1mL吡哆醇标准储备液，稀释至100mL；　

3.10 琼脂培养基：吡哆醇Y培养基5.3g，琼脂1.2g，稀释至100mL； 

3.11 生理盐水：取9g氯化钠溶解于1000mL水中；

3.12 溴甲酚绿（0.4g/L）溶液：称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4mL 0.1mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至守全溶解，用水稀释至250mL。 

4 仪器和设备 

4.1 电热恒温培养箱；

4.2 高压釜；

4.3 液体快速混合器；

4.4 离心机；

4.5 光栅分光光度计；

4.6 硬质玻璃试管。

5 分析步骤 

5.1 菌种的制备及保存（避光处理）

5.1.1 以卡尔斯伯酵母菌 (Saccharomyces Carlsbrgensis ATCC No.9080简称SC)纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在30℃±5℃恒温箱中培养18h～20h，取出，于冰箱中保存，至多不超守两星期。保存数星期以上的菌种，不能立即用作制备接种液之用，一定要在使用前每天移种一次，连续2d～3d，方可使用，否则生长不好。 

5.1.2 种子培养液的制备

加0.5 mL50ng/mL的维生素B6标准应用液于尖头管中，加入5.0mL基本培养基，塞好棉塞，于高压锅121℃消毒10 min，取出，置于冰箱中，此管可保留数星期之久。每次可制备2～4管。 

5.2 试样处理（整个步骤需要避光）

5.2.1 称取试样0.5g～10.0g（维生素B6含量不超过10ng）放入100mL三角瓶中，加72mL0.22mol/L硫酸。放入高压锅121℃下水解5h，取出冷却，用10.0mol/L氢氧化钠和0.5mol/L硫酸调pH至4.5，用溴甲酚绿做指示剂。（指示剂由黄－黄绿色），将三角瓶内的溶液转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，滤纸过滤，保存滤液于冰箱内备用（保存期不超过36h）。

5.2.2 接种液的制备

　　使用前一天，将卡尔斯伯酵母菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时制备两根管，在30℃±5℃恒温箱中培养18h～20h。取出离心10min (3000r/min)倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10mL消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。

5.2.3 标准曲线的制备 

取标准储备液2.00mL稀释至200mL成为中间液，从中间液中取5.00mL稀释至100mL作为工作液，浓度为50ng/mL，3组试管各加0.00，0.02，0.04，0.08，0.12和0.16mL的工作液，再加5.00mL吡哆醇Y培养基，混匀，加棉塞。 

5.2.4 试样管的制备 

在试管中分别加入0.05，0.10，0.20mL样液，再加入5.00mL吡哆醇Y培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅121℃下高压10min，冷至室温备用。 

5.2.5 接种和培养 

每管种一滴接种液，于30℃±5℃恒温箱中培养18h～20h。 

5.3 测定 

将培养后的标准管和试样管从恒温箱中取出后，用分光光度计于550 nm波长下，以标准管的零管调零，测定各管的吸光度值。以标准管维生素B6所含的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制维生素B6标准工作曲线，用试样管得到的吸光度值，在标准曲线上查到试样管维生素B6的含量。

    （下略）