沙门氏菌的测定

                        中华人民共和国国家标准

                            GB 4789.4 1994

                 果品制品－沙门氏菌的测定－计数法

1 范围

本方法为果品制品中沙门氏菌的检验方法。

本方法适用于果品制品中毒样品中沙门氏菌的检验。

2 引用标准

GB/T 4789.28－2003　食品卫生微生物学检验　染色法、培养基和试剂

3 培养基和试剂　

3.1 缓冲蛋白胨水(BP)：

3.1.1 成分：蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)9g、磷酸二氢钾1.5g、蒸馏水1000mL、pH7.2；

3.1.2 制法：按上述成分配好后以大烧瓶装，121℃高压灭菌15min。临用时无菌分装每瓶225mL。 

3.2 氯化镁孔雀绿(MM)增菌液：

3.2.1 甲液：胰蛋白胨5g、氯化钠8g、磷酸二氢钾1.6g、蒸馏水1000mL；

3.2.2 乙液：氯化镁(化学纯) 40g、蒸馏水100mL；

3.2.3 丙液：0.4%孔雀绿水溶液；

3.2.4 制法：分别按上述成分配好后，121℃高压灭菌15min备用。临用时取甲液90mL、乙液9mL、 丙液0.9mL，以无菌操作混合即可。

注：本培养基亦称Rappaport 10(R10)增菌液。

3.3 四硫酸钠煌绿(TTB)增菌液：

3.3.1 基础培养基：多胨或(月示)胨5g、胆盐1g、碳酸钙10g、硫代硫酸钠30g、蒸馏水1000mL；

3.3.2 碘溶液：碘6g、碘化钾5g、蒸馏水20mL；

3.3.3 制法：将基础培养基的各成分加入蒸馏水中，加热溶解，分装每瓶100mL。分装时应随时振 摇，使其中的碳酸钙混匀。121℃高压灭菌15min备用。临用时每100mL基础培养基中加入 碘溶液2mL、0.1%煌绿溶液1mL。

[附(换用方法)：3.3 四硫磺酸钠煌绿增菌液

3.3.1 基础液

蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠3g、碳酸钙45g、蒸馏水1000mL，将各成分加入于蒸馏水中，加热至约70℃溶解，校正pH至7.0±0.1，121℃高压灭菌20min；

3.3.2 硫代硫酸钠溶液

硫代硫酸钠(Na2S2O3•5H2O) 50g、蒸馏水，加至100mL；

3.3.3 碘溶液 

碘片20g、碘化钾25g、蒸馏水，加至100mL，将碘化钾充分溶解于最少量的蒸馏水中，加入碘片，，振摇玻瓶至碘片全部溶解，再加入蒸馏水至规定量。贮于棕色玻瓶内，紧塞瓶盖备用；

3.3.4 煌绿水溶液

煌绿 0.5g、蒸馏水100mL，存放暗处，不少于1d，使其自然灭菌；

3.3.5 牛胆盐溶液 

干燥的牛胆盐10g、蒸馏水10mL，煮沸溶解，121℃高压灭菌20min；

3.3.6 制备 

基础液900mL、硫代硫酸钠溶液100mL、碘液20mL、煌绿溶液2mL、牛胆盐溶液50mL，临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入于基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。分装于灭菌瓶中，每瓶100mL。]

3.4 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液：

3.4.1 成分：蛋白胨5g、乳糖4g、亚硒酸氢钠4g、磷酸氢二钠5.5g、磷酸二氢钾4.5g、L-胱氨酸0.01g、 蒸馏水1000mL；

3.4.2 1%L-胱氨酸-氢氧化钠溶液的配法：称取L-胱氨酸0.1g(或DL-胱氨酸0.2g)，加1mol/L氢氧化钠1.5mL，使溶解，再加入蒸馏水8.5mL即成；

3.4.3 制法：将除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸以外的各成分溶解于900mL蒸馏水中，加热煮沸，俟冷备用。另将亚硒酸氢钠溶解于100mL蒸馏水中，加热煮沸，俟冷，以无菌操作与上液混合。再加入1%L-胱氨酸-氢氧化钠溶液1mL。分装于灭菌瓶中，每瓶100mL，pH应为 7.0±0.1；

3.5 亚硫酸铋琼脂(BS)：

3.5.1 成分：蛋白胨10g、牛肉膏5g、葡萄糖5g、硫酸亚铁0.3g、磷酸氢二钠4g、煌绿0.025g、柠檬酸铋铵2g、亚硫酸钠6g、琼脂18～20g、蒸馏水1000mL、pH7.5；

3.5.2 制法： 

3.5.2.1 将前面5种成分溶解于300mL蒸馏水中；

3.5.2.2 将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠另用50mL蒸馏水溶解；

3.5.2.3 将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸溶解，冷至80℃；

3.5.2.4 将以上三液合并，补充蒸馏水至1000mL，校正pH，加0.5%煌绿水溶液5mL，摇匀。冷至50～55℃，倾注平皿；

注：此培养基不需高压灭菌，制备过程不宜过分加热，以免降低其选择性。应在临用前一天制备，贮存于室温暗处。超过48h不宜使用。 

3.6 DHL琼脂：

3.6.1 成分：蛋白胨20g、牛肉膏3g、乳糖10g、蔗糖10g、去氧胆酸钠1g、硫代硫酸钠2.3g、柠檬酸钠1g、柠檬酸铁铵1g、中性红0.03g、琼脂18～20g、蒸馏水1000mL、pH7.3；

3.6.2 制法：将除中性红和琼脂以外的成分溶解于400mL蒸馏水中，校正pH。再将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸溶解，两液合并，并加入0.5%中性红水溶液6mL，待冷至50～55℃，倾注平板；

3.7 HE琼脂：

3.7.1 成分：(月示)胨12g、牛肉膏3g、乳糖12g、蔗糖12g、水杨素2g、胆盐20g、氯化钠5g、琼脂18～20g、蒸馏水1000mL、0.4%溴麝香草酚蓝溶液16mLAndrade指示剂20mL、甲液20mL、 乙液20mL、pH7.5；

3.7.2 制法：将前面七种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液；将琼脂加入于600mL蒸馏水内， 加热溶解。加入甲液和乙液于基础液内五，校正pH。再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷至50～55℃，倾注平板； 

注：①此培养基不可高压灭菌。 ②甲液的配制 硫代硫酸钠34g、柠檬酸铁铵4g 、蒸馏水100mL ②乙液的配制 去氧胆酸钠10g、蒸馏水100mL。 ②Andrade指示剂 酸性复红 0.5g 1mol/L氢氧化钠溶液16mL、蒸馏水100mL，将复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1～2mL。

3.8 WS琼脂：

3.8.1 成分：(月示)胨12g、牛肉膏3g、氯化钠5g、乳糖12g、蔗糖12g、十二烷基硫酸钠2g、琼脂15g、Andrade指示剂20mL、0.4%溴麝香草酚蓝溶液16mL、甲液20mL、蒸馏水1000mL、 pH7.0；

3.8.2 制法：除指示剂和甲液外，将其他成分加热溶解，不需消毒，校正pH后加入指示剂和甲液，倾注平板应呈草绿色； 

注：①供沙门氏菌分离用。 ②Andrade指示剂和甲液的配制均见HE琼脂。

3.9 SS琼脂：

3.9.1 基础培养基：牛肉膏5g、(月示)胨5g、三号胆盐3.5g、琼脂17g、蒸馏水1000mL，将牛肉膏、(月示)胨和胆盐溶解于400mL蒸馏水中，将琼脂加入于600mL蒸馏水中，煮沸使其溶解，再将两液混合，121℃高压灭菌15min，保存备用；

3.9.2 完全培养基：基础培养基1000mL、乳糖10g、柠檬酸钠8.5g、硫代硫酸钠8.5g、10%柠檬酸铁溶液10mL、1%中性红溶液2.5mL、0.1%煌绿溶液0.33mL，加热溶化基础培养基，按比例加入上述染料以外之各成分，充分混合均匀，校正至pH 7.0，加入中性红和煌绿溶液，倾注平板；    

注：①制好的培养基宜当日使用，或保存于冰箱内于48h内使用。 ②煌绿溶液配好后应在10d以内使用。 ③可以购用SS琼脂的干燥培养基。

3.10 三糖铁琼脂：

3.10.1 成分：蛋白胨15g、 (月示)胨5g、牛肉膏3g、酵母膏3g、乳糖10g、蔗糖10g、葡萄糖1g、 氯化钠5g、硫酸亚铁0.2g、硫代硫酸钠0.2g、琼脂12g、酚红0.025g、蒸馏水1000mL、pH7.4；

3.10.2 制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层。121℃高压灭菌15min，放置高层斜面备用；

3.11 蛋白胨水、靛基质试剂：

3.11.1 成分：蛋白胨(或胰蛋白胨)20g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL调 pH7.4； 

3.11.2 制法：按上述成分配制，分装小试管，121℃高压灭菌15min； 

3.11.3 靛基质试剂： 

3.11.3.1 柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸25mL； 

3.11.3.2 欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL；

3.11.4 试验方法：挑取小量培养物接种，在36±1℃培养1～2d，必要时可培养4～5d。加入柯凡克试剂约0.5mL轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色；

注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。

3.12 尿素琼脂(pH7.2)：

3.12.1 成分：蛋白胨1g、氯化钠5g、葡萄糖1g、磷酸二氢钾2g、0.4%酚红溶液3mL、琼脂20g、蒸馏水1000mL、20%尿素溶液100mL pH7.2±0.1； 

3.12.2 制法：将除尿素和琼脂以外的成分配好，并校正pH，加入琼脂，加热溶化并分装烧瓶。121℃高压灭菌15min。冷至50～55℃，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%最终pH应为7.2±0.1。分装于灭菌试管内，放成斜面备用； 

3.12.3 试验方法：挑取琼脂培养物接种，在36±1℃培养24h，观察结果，尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色；

3.13 氰化钾(KCN)培养基：

3.13.1 成分：蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾0.225g、磷酸氢二钠5.64g、蒸馏水1000mL、0.5%氰化钾溶液20mL，pH7.6；

3.13.2 制法：将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶，121℃高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL(最后浓度为1∶10000)，分装于12mm ×100mm灭菌试管，每管约4mL 立刻用灭菌橡皮塞塞紧，放在4℃冰箱内，至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用； 

3.13.3 试验方法：将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾(KCN)培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在36±1℃培养1～2d，观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制)，经2d细菌不生长为阴性(抑制)； 

注：氰化钾是剧毒药物，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。

3.14 氨基酸脱羧酶试验培养基：

3.14.1 成分：蛋白胨5g、酵母浸膏3g、葡萄糖1g、蒸馏水1000mL、1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1mL、L-氨基酸或DL-氨基酸0.5或1g/100mL，pH6.8；

3.14.2 制法：除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min；

3.14.3 试验方法：从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36±1℃培养18～24h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色；

3.15 糖发酵管：

3.15.1 成分：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠3g、磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)2g、0.2%溴麝香草酚蓝溶液12mL、蒸馏水1000mL，pH7.4；

3.15.2 制法：葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min； 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL，121℃高压灭菌15min。 另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内， 以无菌操作分装小试管；

注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。

3.15.3 试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36±1℃培养，一般观察2～3d。迟缓反应需观察14～30d。

3.16 ONPG培养基

3.16.1 成分：邻硝基酚β-D-半乳糖苷(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)60mg、0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5)10mL、1%蛋白胨水(pH7.5)30mmL；

3.16.2 制法：将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10mm×75mm试管，每管0.5mL，用橡皮塞塞紧；

3.16.3 试验方法：自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种，于36±1℃培养1～3h和24h观察结果。如果β-半乳糖苷酶产生，则于1～3h变黄色，如无此酶则24h不变色；

3.17 半固体琼脂：将蛋白胨1g、牛肉膏0.3g、氯化钠0.5g、琼脂0.35～0.4g、蒸馏水100mL成分配好，煮沸使其溶解，校正pH7.4，分装小试管。121℃高压灭菌15min。直立凝固备用；

注：供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。

3.18 丙二酸钠培养基：

3.18.1 成分：酵母浸膏1g、硫酸铵2g、磷酸氢二钾0.6g、磷酸二氢钾0.4g、氯化钠2g、丙二酸钠3g、0.2%溴麝香草酚蓝溶液12mL、蒸馏水1000mL、pH6.8；

3.18.2 制法：先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正pH后再加入指示剂，分装试管，121℃高压灭菌15min；

3.18.3 试验方法：用新鲜的琼脂培养物接种，于36±1℃培养48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。

3.19 沙门氏菌因子血清：按26种用于初步分型；57种用于进一步分型；163种用于详细分型。

4 设备和材料

4.1 冰箱；

4.2 温箱；

4.3 显微镜；

4.4 均质器或灭菌乳钵；

4.5 架盘药物天平；

4.6 灭菌广口瓶；

4.7 灭菌锥形瓶；

4.8 灭菌吸管；

4.8 灭菌平皿；

4.9 灭菌培养皿；

4.10 灭菌小试管；

4.11 灭菌毛细管。

    (下略)